La infección por Xanthomonas y el estrés por ozono influyen claramente en la estructura de la comunidad microbiana y las interacciones en la filosfera del pimiento

May 03, 2023

ISME Communications volumen 3, Número de artículo: 24 (2023) Citar este artículo

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Si bien la respuesta fisiológica y transcripcional del huésped al estrés biótico y abiótico se ha estudiado intensamente, se sabe poco sobre la resiliencia de los microbiomas asociados y su contribución a la tolerancia o respuesta a estos estreses. Evaluamos el impacto del ozono troposférico elevado (O3), individualmente y en combinación con la infección por Xanthomonas perforans, en condiciones de campo de cámara abierta sobre el resultado general de la enfermedad en cultivares de pimiento resistentes y susceptibles, y su estructura, función y red de interacción del microbioma asociado. a lo largo de la temporada de crecimiento. La infección por patógenos resultó en una estructura y funciones distintas de la comunidad microbiana en el cultivar susceptible, mientras que el estrés por O3 concurrente no alteró más la estructura y función de la comunidad. Sin embargo, el estrés por O3 exacerbó la gravedad de la enfermedad en el cultivar resistente. Esta alteración de la gravedad de la enfermedad se acompañó de una mayor heterogeneidad en los recuentos de población de Xanthomonas asociados, aunque no fue evidente un cambio significativo en la densidad general de la microbiota, la estructura de la comunidad microbiana y la función. Las redes de coocurrencia microbiana bajo estrés por O3 y desafío de patógenos simultáneos indicaron un cambio en los taxones más influyentes y una red menos conectada, lo que puede reflejar la estabilidad alterada de las interacciones entre los miembros de la comunidad. El aumento de la gravedad de la enfermedad en el cultivo resistente puede explicarse por dicha red de coocurrencia microbiana alterada, lo que indica el escudo profiláctico alterado asociado al microbioma contra los patógenos bajo niveles elevados de O3. Nuestros hallazgos demuestran que las comunidades microbianas responden claramente a factores estresantes individuales y simultáneos, en este caso, el estrés por O3 y la infección por patógenos, y pueden desempeñar un papel importante en la predicción de cómo cambiarían las interacciones planta-patógeno ante el cambio climático.

La filosfera (partes aéreas) de las plantas es un hábitat único, pobre en nutrientes y está habitado por varios microorganismos procariotas y eucariotas [1] que colonizan la superficie de la hoja (epífitas) o el interior del tejido de la hoja (endofitas) [2, 3] . El ensamblaje y la sucesión de la comunidad microbiana de la hoja están influenciados por procesos deterministas y estocásticos. Aunque la dispersión de las plantas vecinas y otros factores demográficos, como la identidad del vecino y la edad, son factores que contribuyen a la diversidad del microbioma de la filosfera [4], los factores del huésped de la planta, como el genotipo del huésped, la etapa de desarrollo [5] y la resistencia del huésped [6], dan forma al ensamblaje del microbioma. . Este filtrado del microbioma del huésped se observa debido a la diferente disponibilidad de recursos en la superficie de la hoja [7], las diferentes propiedades físicas [8] y la señalización de defensa del huésped [9, 10].

Se sabe que los miembros del microbioma de la filosfera desempeñan un papel en la adquisición de nutrientes [11], el crecimiento y la productividad de las plantas [12] y la tolerancia a diversos estreses bióticos y abióticos [13,14,15,16,17]. La invasión de patógenos es uno de los estreses bióticos más influyentes que afectan el ensamblaje microbiano de la planta en la filosfera [18]. Los patógenos pueden modificar el hábitat mediante la secreción de factores de virulencia, biosurfactantes u hormonas, lo que aumenta la disponibilidad de recursos para que florezcan otros colonizadores residentes, incluidos los oportunistas [19, 20]. Los patógenos también pueden influir en la microflora residente a través de la competencia por nichos o recursos [1, 18, 19, 21]. La señalización de defensa de las plantas activada en respuesta al ataque de patógenos también se ha indicado como una fuente de alteración de la comunidad de la filosfera [16, 22]. Independientemente de la fuente de cambio de la comunidad de la filosfera, se cree que los miembros dominantes restauran la estabilidad de esta comunidad perturbada [23]. Además, cada vez más evidencia ha sugerido que las plantas pueden reclutar microbios en la filosfera que ofrecen protección contra patógenos [24,25,26], lo que indica un ensamblaje de microbiomas supresores de enfermedades en la filosfera en respuesta al patógeno similar a lo que se ha observado en la rizosfera [ 27, 28]. La estructura y composición de la comunidad microbiana de la filosfera también está determinada por la respuesta de la planta huésped al estrés abiótico, como la sequía [29, 30], el aumento de la temperatura superficial o el calentamiento [31,32,33], el CO2 elevado [34] y la radiación ultravioleta [ 35].

Los factores de estrés abióticos pueden alterar la susceptibilidad del huésped a los patógenos al interferir con la señalización de la hormona de defensa [36] y, por lo tanto, influir en la incidencia de la enfermedad. La exposición de las plantas a factores estresantes bióticos y abióticos simultáneos puede generar impactos positivos o negativos en las respuestas de las plantas según el momento, la naturaleza y la gravedad de cada estrés, ya que las diferentes vías de señalización de defensa pueden interactuar o inhibirse entre sí [37, 38]. Además, trabajos recientes han demostrado que el cambio climático puede conducir a una mayor incidencia de brotes de enfermedades debido a la propagación de patógenos fuera de su área de distribución geográfica [39]. En conjunto, hay muchos factores internos y externos que pueden dar forma al microbioma de la filosfera, y se necesita trabajar para comprender completamente el papel que desempeña el microbioma de la filosfera en la respuesta de la planta a los factores estresantes bióticos y abióticos simultáneos.

Uno de esos factores estresantes abióticos que experimentan las plantas son los niveles elevados de ozono troposférico (O3). El calentamiento global causado por los gases de efecto invernadero ha provocado un aumento del O3 troposférico debido al aumento de precursores como el óxido de nitrógeno (NOx), el CO, el metano y otros compuestos orgánicos volátiles [40, 41]. Un estudio en los EE. UU. predijo que el percentil 5 al 95 para el O3 máximo diario de 8 horas aumentará de 31 a 79 partes por billón (ppb) en 2012 a 30 a 87 ppb en 2050 [42]. Este aumento en el nivel de O3 es significativo ya que las concentraciones de O3 por encima de 40 ppb son altamente fitotóxicas [43]. El O3 elevado puede tener un impacto negativo en las plantas y en muchos niveles, incluido el daño visible y la reducción de la fotosíntesis, lo que a su vez afecta el crecimiento de las plantas, el valor nutricional, el rendimiento de los cultivos y las alteraciones en la asignación de carbono [43,44,45]. A medida que aprendemos más sobre cómo los factores estresantes bióticos y abióticos asociados con el cambio climático influyen en la respuesta de la planta a nivel molecular, celular o transcriptómico, las preguntas importantes a abordar son cómo respondería el microbioma asociado o cómo contribuiría a la respuesta de la planta en presencia de factores estresantes individuales o simultáneos y si las funciones ecológicas críticas de las comunidades microbianas de la filosfera se verían alteradas en presencia de factores estresantes.

Para abordar estas preguntas, nos enfocamos explícitamente en la respuesta del microbioma de la filosfera de dos cultivares de pimiento que difieren en resistencia a un patógeno foliar, Xanthomonas perforans, en presencia de niveles elevados de O3 en el ambiente. Usamos una configuración experimental en el campo que involucraba cámaras abiertas (OTC) que nos permitieron manipular los niveles de O3 y diseccionar la influencia de las interacciones genotipo x ambiente (G x E) en el resultado general de la enfermedad de las plantas, así como en la estructura del microbioma. y función Los dos cultivares de pimiento usados ​​en este estudio diferían en su resistencia contra X. perforans, un patógeno de pimiento emergente en el sureste de los EE. tener resistencia cuantitativa poligénica contra las once razas del patógeno de la mancha bacteriana [46]. Este sistema patogénico específico nos permitió no solo estudiar la respuesta de la variedad resistente bajo factores estresantes combinados, evaluando así su durabilidad bajo condiciones climáticas alteradas, sino también probar la respuesta de la especie patógena de pimiento emergente, X. perforans [47] , sobre las variedades susceptibles y resistentes comerciales bajo un ambiente alterado. Presumimos que las comunidades microbianas de la filosfera mostrarán alteraciones tanto en los perfiles taxonómicos como funcionales y en la dinámica estacional alterada en respuesta a niveles alterados de O3, independientemente de los cultivares. Curiosamente, la influencia del O3 elevado en la susceptibilidad de la planta depende del estilo de vida del patógeno. Dichos efectos diferenciales podrían deberse a diferencias fisiológicas, biología de patógenos o diferencias en las vías de señalización de defensa [48,49,50]. Presumimos que la presencia de O3 elevado aumentará la susceptibilidad general del pimiento a las xanthomonads bacterianas, incluso en el cultivar resistente. También planteamos la hipótesis de que el establecimiento de la enfermedad interrumpiría la dinámica estacional del microbioma de la filosfera, y este efecto será más fuerte en los entornos que soportan una alta presión de la enfermedad. Nuestro diseño experimental nos permitió abordar la influencia del O3 elevado en el resultado general de la enfermedad en cultivares que difieren en su resistencia a los patógenos, así como también facilitó la evaluación de los perfiles taxonómicos y funcionales del microbioma de la filosfera bajo factores estresantes simultáneos. Por último, como los estudios han indicado la importancia de las funciones en lugar de las especies en la estructura y el ensamblaje de la comunidad [51], comparamos los perfiles funcionales de los microbiomas para ver si las funciones ecológicas de la comunidad se conservan independientemente de los factores estresantes bióticos o abióticos.

El experimento se realizó en el sitio de Deposición Atmosférica (AtDep) en la Universidad de Auburn (Fig. S1A) en la temporada de crecimiento de 2021 (mayo-julio), donde aprovechamos los OTC (Fig. S1B) que nos permitieron probar el efecto del estrés por O3 sobre las interacciones planta-patógeno-microbioma y abordar la complejidad de la compensación de defensa-desarrollo de la planta. Usamos 12 cámaras para la fumigación, donde seis cámaras tenían un ambiente ambiental y seis tenían O3 elevado (Fig. S1A). Cada cámara de O3 elevada contiene cuatro generadores de O3 (generador de ozono HVAC-1100, Ozone Technologies, Hull, IA, EE. UU.), equipados con dos bombillas ultravioleta (Modelo GPH380T5VH/HO/4 P, Ozone Technologies, Hull, IA, EE. UU.) el O3. Los generadores y las bombillas están ubicados dentro de las cajas elevadas del ventilador de la cámara de O3. Para alcanzar el punto de ajuste deseado de O3 (~100 ppb), los generadores de O3 se controlaron mediante cables de control de 0 a 10 V, que se controlan a través de un módulo de salida analógica. Para fumigar las plantas, se sopló aire ozonizado desde la caja del ventilador hacia el revestimiento de plástico de la cámara abierta (Fig. S1B). El panel de plástico en la parte inferior de la cámara tiene paredes dobles con orificios en el panel interior, lo que permite que el O3 se libere sobre las plantas dentro de la cámara. Cada cámara está conectada a través de un tubo de plástico a un colector de gas central al que cada cámara se abre secuencialmente mediante válvulas de solenoide de 3 vías. Un microcontrolador pasa por las 12 válvulas de solenoide cada 24 min (muestreando cada una de las 12 cámaras durante 2 min) para monitorear el O3 de cada cámara (Monitor de ozono de doble haz modelo 205, 2B Technologies, Boulder, CO, EE. UU.) durante la ventana de fumigación ( 10 a 18 hs). Durante este experimento, el [O3] promedio en las cámaras de control fue de alrededor de 30,6 ppb, mientras que las cámaras fumigadas tenían un [O3] promedio de alrededor de 90,3 ppb (Fig. S1C). Los niveles de O3 en las cámaras elevadas fueron significativamente más altos durante la temporada de crecimiento en comparación con las cámaras ambientales (Kruskal-Wallis, p = 0,04), mientras que los niveles de O3 entre las cámaras elevadas fueron similares (p = 0,62).

La inoculación se realizó en plántulas de 5 a 6 semanas de edad de ambos cultivares. Las plantas se inocularon con una suspensión de X. perforans ajustada a 106 CFU/ml en tampón MgSO4 modificado con 0,0045 % (vol/vol) de Silwet L-77 (PhytoTechnology Laboratories, Shawnee Mission, KS, EE. UU.). Las plantas de control se inocularon por inmersión en tampón MgSO4 modificado con 0,0045 % (vol/vol) de Silwet L-77 (Fig. S1D). Las plantas inoculadas por inmersión se trasplantaron a macetas de plástico estériles de 10 pulgadas (The HC Companies, OH) con medio de cultivo sin suelo (Premier Tech Horticulture, PA). Luego, las macetas se transfirieron a los OTC antes mencionados y se mantuvieron dentro de los OTC durante la temporada de crecimiento hasta la cosecha. En cada una de las cámaras, teníamos seis plantas, cada una de Early Cal Wonder (en lo sucesivo, el cultivar susceptible) y PS 09979325 (en lo sucesivo, el cultivar resistente) (Fig. S1E). Entre las 12 cámaras, las plantas en 6 cámaras (tres ambientales y tres con O3 elevado) se inocularon con el patógeno X. perforans, mientras que 6 cámaras (tres con ambiente y tres con O3 elevado) tenían plantas de control inoculadas con tampón MgSO4 (Fig. S1A).

El desarrollo general de la enfermedad se evaluó estimando el porcentaje de síntomas de la enfermedad causados ​​por la mancha bacteriana después de transformar las calificaciones de Horsfall-Barratt [52] al punto medio del rango de calificación durante la mitad y el final de la temporada [53].

Se recolectaron muestras de hojas de pimiento tanto de muestras inoculadas como de control de cada cultivar por separado después de la inoculación con tampón Xanthomonas o MgSO4 y antes de mantener las plantas en las cámaras (muestras base), seguidas de otros dos puntos de tiempo durante la temporada de crecimiento (mediados y finales de la temporada). Para cada punto de tiempo, se agruparon hojas de 6 plantas de cada cultivar cultivadas dentro de una cámara, por lo que tenemos una muestra por cultivar. Durante el muestreo, las hojas se recolectaron al azar para evitar sesgos hacia hojas enfermas y con al menos una hoja por planta para cada cultivar. Se sometieron a ultrasonidos 40 gramos de muestras de hojas durante 15 minutos en solución salina tamponada con fosfato (50 mM) modificada con Tween 20 al 0,02 % y las células desprendidas se sedimentaron y procesaron para la extracción de ADN. Brevemente, el ADN total se extrajo con el kit de purificación de ADN genómico Wizard® (Promega, Madison, WI) según las instrucciones del fabricante con la adición de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:1) seguido de precipitación con etanol. El ADN se cuantificó utilizando un fluorómetro Qubit 3.0 (Thermo Fischer, Waltham, MA) y las muestras de ADN se enviaron al núcleo de secuenciación del Centro de Biología Genómica y Computacional de Duke (Universidad de Duke, Durham, NC) para la preparación de bibliotecas y análisis de extremos emparejados. las lecturas (2 × 150 pb) se secuenciaron en el sistema de celdas de flujo NovaSeq 6000 S1. Luego, las lecturas sin procesar se recortaron para determinar la calidad con BBDuk (http://jgi.doe.gov/data-and-tools/bb-tools/), seguido de la eliminación de la contaminación del host con KneadData (https://bitbucket.org/biobakery/ kneaddata/) utilizando pimiento cv. 59 (GCA_021292125.1) genoma como referencia.

Las lecturas con control de calidad y descontaminadas del host se asignaron taxonómicamente usando Kraken2 (v2.1.2) [54] contra una base de datos Kraken2 estándar que contiene bibliotecas RefSeq [55] de secuencias arqueológicas, bacterianas, humanas y virales (a partir del 1 de marzo de 2022). Kraken2 es un sistema de clasificación de lectura corta basado en kmer que asigna una identificación taxonómica a cada lectura de secuenciación utilizando el ancestro común más bajo (LCA) de los genomas coincidentes en la base de datos y se ha utilizado para la clasificación de alta precisión de lecturas metagenómicas [56, 57]. Los archivos de informe de Kraken2 se utilizaron como entradas para ejecutar la reestimación bayesiana de la abundancia con Kraken (Bracken) (v2.6.2) [58] para reestimar la abundancia en cada rango taxonómico para todas las muestras. Bracken usa las etiquetas de taxonomía asignadas por Kraken para estimar la abundancia de cada especie. La base de datos para Bracken se construyó posteriormente con la base de datos Kraken2 utilizando la longitud predeterminada de 35 k-mer y longitudes de lectura de 100 pb basadas en la longitud de lectura promedio en nuestra muestra con la longitud de lectura más baja para volver a estimar la abundancia relativa de comunidades microbianas en el nivel de especie. Los resultados de Bracken se combinaron mediante la función combine_bracken_outputs.py para el análisis posterior. Se utilizó la herramienta kraken-biom (https://github.com/smdabdoub/kraken-biom) para convertir la salida de Bracken en tablas de formato BIOM para análisis de diversidad en R [59].

Además de la abundancia relativa de cada taxón, calculamos una estimación de la abundancia absoluta basada en la abundancia relativa de diferentes taxones bacterianos y el ADN total recuperado de cada muestra. La densidad de microbiota descrita como ADN total (ng) por mg de muestra fresca se calculó para cada muestra, que luego se utilizó para calcular la abundancia absoluta de diferentes taxones microbianos definida por ng de ADN por mg de muestra multiplicada por la abundancia relativa [60 ].

Se accedió a la composición taxonómica y la diversidad de eucariotas en las muestras utilizando EukDetect (v1.3) [61]. EukDetect alinea las lecturas metagenómicas con genes marcadores universales de familias de genes conservados seleccionadas de hongos, protistas, metazoos no vertebrados y genomas y transcriptomas de arqueoplastidos no estreptofitos seguidos de un filtrado de lecturas duplicadas y de baja calidad. La abundancia final de eucariotas se calcula filtrando taxones con menos de cuatro lecturas y alineándose con menos de dos genes marcadores. La abundancia absoluta resultante (lecturas por kilobase de secuencia) se utilizó para comparar la diversidad entre las muestras. El valor de RPKS se normalizó multiplicándolo por un factor de escala calculado dividiendo el tamaño medio de la biblioteca por el tamaño de la biblioteca de muestras, que luego se usó para comparar las muestras.

Para determinar el efecto del cultivo y el ambiente sobre la abundancia de X. perforans, se utilizó un método dependiente del cultivo para rastrear la población de Xanthomonas en la planta. Las plantas (6 de cada cultivar/cámara) se inocularon por inmersión como se describió anteriormente y se mantuvieron dentro de las cámaras con O3 ambiental y elevado. Se tomaron muestras de hojas los días 0, 7 y 14 después de la inoculación para determinar la población bacteriana in planta. En cada tiempo de muestreo, se tomaron aproximadamente 4 cm2 de área foliar con un sacacorchos estéril y se maceraron con una Dremel® estéril en tubos de microcentrífuga con 1 ml de tampón MgSO4 0,01 M estéril. A continuación, la suspensión homogeneizada se diluyó diez veces y luego se sembró en una placa de agar nutritivo utilizando un sembrador en espiral (Neu-tecGroup Inc., NY). Luego, las placas se incubaron a 28 °C durante 3 días y la población bacteriana se determinó como unidades formadoras de colonias por centímetro cuadrado de área foliar.

Todos los análisis estadísticos y de diversidad se realizaron con R (v4.1.3) [59] y Rstudio [62] con Phyloseq (v1.38.0) [63], vegan (v2.5–7) [64] y ggplot2 (v3 .3.5) [65] bultos. Antes del análisis de datos, el tamaño de la biblioteca se normalizó mediante el escalado con submuestreo clasificado con la función 'SRS' en el paquete SRS R (v0.2.2) [66]. Se utilizaron las medidas de diversidad alfa Chao1 y el índice de Shannon para identificar la riqueza y diversidad de la comunidad, respectivamente. La prueba de suma de rangos de Wilcoxon probó diferencias significativas en los índices de diversidad alfa para datos no paramétricos y la prueba T para datos distribuidos normalmente. La idoneidad de estos métodos se verificó comprobando la distribución normal de los residuos con base en la prueba de normalidad de Shapiro-Wilk.

Las diferencias en los perfiles microbianos generales entre los cultivares y las diferentes condiciones ambientales (diversidad β) se estimaron utilizando la distancia Bray-Curtis. Para comprender los factores que contribuyen a la estructura de la comunidad microbiana, realizamos un análisis de varianza multivariante de permutación (PERMANOVA) [67] como se implementó en adonis2 (análisis de varianza usando matrices de distancia, ADONIS) con el argumento 'por' establecido en 'márgenes' y análisis de similitudes (ANOSIM) con 1000 permutaciones (p = 0,05) utilizando la disimilitud de Bray-Curtis en el paquete vegano R (v 2,5-7). Además, se realizó la prueba de dispersión de grupo de homogeneidad multivariada (BETADISPER) [68] para determinar la dispersión homogénea entre los factores en relación con sus taxones microbianos. El escalamiento multidimensional no métrico (NMDS) entre los grupos de muestra se calculó mediante la disimilitud de Bray-Curtis y se visualizó mediante el paquete ggplot2 en R.

Para nuestro análisis de red, los datos taxonómicos se dividieron en al menos un 0,5 % de abundancia relativa en más del 20 % de las muestras (prevalencia) para garantizar que todas las muestras tuvieran suficiente profundidad de secuenciación para recuperar la mayor parte de la diversidad. El análisis de la red de correlación se realizó utilizando el enfoque SPRING [69] implementado en el paquete R NetCoMi (v1.1.0) [70]. Las estructuras comunitarias a lo largo del tratamiento se estimaron utilizando el algoritmo "cluster_fast_greedy" [71], y los taxones centrales se determinaron utilizando el umbral de 0,95. Se usó un índice de Jaccard para probar las similitudes (Jacc = 0, similitud más baja y Jacc = 1, similitud más alta) en medidas de centralidad de red local seleccionadas (grado, centralidad de intermediación, centralidad de cercanía y centralidad de vector propio) para determinar el centro o los taxones clave. . Se realizó una evaluación cuantitativa de la red con un enfoque de permutación (1000 bootstraps) con una corrección adaptativa de Benjamini-Hochberg para pruebas múltiples.

El perfil funcional de las comunidades microbianas se realizó en secuencias de extremos emparejados concatenadas con HUMAnN3 (v3.0) [72] para cuantificar la abundancia de genes (familias de genes UniRef90) [73] y rutas MetaCyc [74]. Se utilizó la base de datos de nucleótidos ChocoPhlAn v30 para la estimación de la cobertura y la abundancia de la vía funcional. Las familias de genes y las tablas de abundancia de rutas se normalizaron en copias por millón de lecturas (CPM) para facilitar las comparaciones entre muestras con diferentes profundidades de secuenciación. Luego, la salida de HUMAnN3 se importó a QIIME2 (v2021.11) [75] para generar ordenaciones de escalado multidimensional no métrico (NMDS) utilizando la matriz diferente de Bray-Curtis. Para comprender los factores que impulsan los perfiles funcionales, realizamos un análisis de varianza multivariante de permutación (PERMANOVA) [67] como se implementó en adonis2 (análisis de varianza usando matrices de distancia, ADONIS) y análisis de similitudes (ANOSIM) con 1000 permutaciones (p = 0.05 ) con diferentes factores (cultivares, ambiente, estado de inoculación y tiempo de muestreo), como se describió anteriormente. Las vías diferencialmente abundantes a lo largo del tratamiento se identificaron utilizando LEfSe (Análisis discriminante lineal del tamaño del efecto) (v1.1.2) [76]. Las vías con un valor de p corregido de 0,05 o menos y una puntuación del Análisis Discriminante Lineal (LDA) de log >2,5 se clasificaron como significativamente aumentadas dentro de uno de los dos grupos.

En general, se registró un índice de gravedad de la enfermedad más alto en el cultivar susceptible en comparación con el cultivar resistente. En condiciones ambientales, el cultivar susceptible soportó un índice de gravedad de la enfermedad promedio de 53,01 % durante la mitad de la temporada, que disminuyó a 15,11 % al final de la temporada de crecimiento. El cultivar resistente soportó una enfermedad mínima con un índice de gravedad de la enfermedad de 0,37 % a mitad de temporada y de 0,29 % al final de la temporada. El O3 elevado no afectó la gravedad de la enfermedad en el cultivar susceptible. Sin embargo, se observó un índice de severidad de la enfermedad significativamente mayor en el cultivar resistente en condiciones elevadas de O3, tanto a mitad de temporada (12,61 %) (p < 0,001) como al final de la temporada (2,01 %) (p = 0,01) en comparación con la temperatura ambiente. ambiente (media temporada = 0.37%, final de temporada = 0.29%) (Fig. 1, Tabla S1).

Gráficos de caja y bigotes que muestran el índice de gravedad de la enfermedad (representado como valor porcentual) en condiciones ambientales y de O3 elevadas en cultivares susceptibles y resistentes. Los niveles de significación para cada combinación de tratamientos se indican mediante *p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001; **** p < 0,0001.

Las muestras recolectadas al comienzo del experimento (muestras base) y dos veces durante la temporada de crecimiento (a mitad de temporada y al final de la temporada) se sometieron a secuenciación de metagenoma de escopeta, que produjo de 2,83 a 17,16 Gbps de lecturas sin procesar por muestra. El recorte del adaptador y la eliminación de lecturas de baja calidad dieron como resultado la pérdida del 4,3 al 11,3 % del total de lecturas entre diferentes muestras. De las lecturas recortadas de calidad, del 5,78 al 39,09 % de las lecturas se identificaron como lecturas del host y se eliminaron del análisis posterior. Las muestras en la etapa inicial de plántula arrojaron muy pocas lecturas al filtrarlas debido a una mayor contaminación del huésped (23–39 %), lo que indica una colonización microbiana mínima en las plántulas cultivadas en invernadero antes del trasplante. Alrededor del 50,61 % al 84,56 % de las lecturas totales originales se retuvieron para el análisis posterior (Tabla S2).

Luego investigamos el efecto de la inoculación y el O3 elevado y su interacción en la diversidad microbiana general y la riqueza de las comunidades de la filosfera. Los valores generales de riqueza y diversidad bacteriana en las muestras de la mitad y el final de la temporada fueron más altos en las plantas de control en comparación con las muestras base. Esto podría atribuirse a los bajos niveles de colonización microbiana en las muestras base cultivadas en invernadero que aumentaron en diversidad y riqueza al exponerse a las condiciones naturales del campo. La diversidad eucariótica en las muestras base no se calculó ya que estas muestras tenían recuentos de lecturas por debajo del umbral (menos de 4 lecturas que se alinean con menos de 2 genes marcadores) para considerarse presente en la muestra. El estrés por O3 por sí solo no influyó en la riqueza y diversidad bacteriana (Tabla S3) y eucariótica (Tabla S4) en ambos cultivares. Sin embargo, la infección por patógenos condujo a una riqueza bacteriana significativamente menor (p < 0,001) (Fig. 2A) y diversidad (Kruskal-Wallis, p = 0,01) (Fig. 2B), así como a una menor riqueza eucariótica (Kruskal-Wallis, p = 0,01). ) (Fig. 2C) y diversidad (Kruskal-Wallis, p = 0,02) (Fig. 2D) en el cultivar susceptible en condiciones ambientales durante toda la temporada de crecimiento en comparación con las plantas de control. Bajo estrés combinado del patógeno y O3 elevado, hubo un efecto significativo tanto en la riqueza (p = 0.01) como en la diversidad (p = 0.04) solo durante el final de la temporada en el cultivar susceptible. La inoculación y el O3 elevado no influyeron en la riqueza bacteriana (pinoc = 0,81, penv = 0,07) (Fig. 2A) ni en la diversidad (pinoc = 0,27, penv = 0,62) (Fig. 2B), ni en la riqueza eucariótica (Kruskal-Wallis, pinoc = 0,08, penv = 0,31) (Fig. 2C) y diversidad (Kruskal-Wallis, pinoc = 0,23, penv = 0,82) (Fig. 2D) en el cultivar resistente. El momento del muestreo tuvo una influencia significativa en la riqueza y diversidad bacteriana (p < 0.01) en ambos cultivares.

Sin embargo, la infección por patógenos en cultivares susceptibles reduce la riqueza y diversidad de la comunidad microbiana. A Riqueza bacteriana Chao1 y B Índice de diversidad bacteriana de Shannon en diferentes entornos. C Diversidad de la comunidad eucariótica y riqueza de D en diferentes tratamientos. Las muestras inoculadas y de control se indican con barras amarillas y verdes en la parte superior, mientras que los tratamientos con O3 ambiental y elevado se indican con barras de color azul claro y rojo en la parte inferior, respectivamente.

Para visualizar las diferencias en la estructura de la comunidad bacteriana y eucariótica entre muestras de dos cultivares de pimiento y dos condiciones ambientales, los perfiles de abundancia taxonómica se usaron para calcular la matriz de distancia Bray-Curtis y se representaron en dos dimensiones usando un escalado multidimensional no métrico (NMDS). Para comprender la influencia relativa de cada factor y su interacción en la estructura general de la comunidad microbiana de la filosfera, realizamos un PERMANOVA en las disimilitudes de Bray-Curtis utilizando el cultivar, el momento del muestreo, el medio ambiente y la inoculación como variables independientes. En general, el efecto del cultivar, el tiempo de muestreo y la inoculación fueron muy significativos en la formación de comunidades bacterianas (p < 0,001), además de las interacciones del cultivo, el tiempo y la inoculación (p = 0,03) (Tabla S5A), con separación de plantas susceptibles inoculadas a partir de plantas control susceptibles, inoculadas y resistentes al control (Fig. 3A). Además, evaluamos la influencia y las interacciones de los factores individuales en dos puntos de muestreo. El efecto del cultivar fue significativo pero disminuyó durante la temporada de crecimiento (media temporada: R2 = 0,23, p < 0,001; final de temporada: R2 = 0,06, p = 0,03). Por el contrario, el efecto de la inoculación aumentó durante el transcurso de la temporada de crecimiento (media temporada: R2 = 0,20, p < 0,001; final de temporada: R2 = 0,55, p < 0,001) (Tabla S5B, C). El efecto de la interacción entre el cultivar y la inoculación en las comunidades bacterianas se mantuvo estadísticamente significativo a lo largo del tiempo, aunque el tamaño del efecto disminuyó al final de la temporada de crecimiento (mitad de la temporada: R2 = 0,15, p < 0,01; final de la temporada: R2 = 0,05, p = 0,04). El efecto del O3 elevado fue mínimo, y no fue estadísticamente significativo al final de la temporada de crecimiento (media temporada: R2 = 0,05 p = 0,04; final de la temporada: R2 = 0,02, p = 0,15) (Tabla S5B, C). La interacción entre el ambiente y otras variables no fue estadísticamente significativa a lo largo de la temporada de crecimiento. Un aumento en los niveles de O3 no alteró la estructura de la comunidad bacteriana en el cultivar susceptible. Sin embargo, influyó en las comunidades bacterianas del cultivar resistente (R2 = 0,14, p = 0,02) (Tabla S5D) en ausencia de Xanthomonas. No hubo diferencia en las comunidades microbianas entre las cámaras con O3 elevado (p = 0,69) o ambiente ambiental (p = 0,85), lo que sugiere que no hay efecto de la cámara en la diversidad bacteriana general (Tabla S5E, F).

Una ordenación de escala multidimensional no métrica (NMDS) que compara la diversidad de la comunidad bacteriana en dos cultivares, las condiciones ambientales y el momento del muestreo. Ordenación B NMDS que compara la diversidad de la comunidad eucariótica entre dos cultivares, las condiciones ambientales y el momento del muestreo.

Al igual que las comunidades bacterianas, la diversidad de las comunidades eucariotas también estuvo significativamente influenciada por el medio ambiente, el cultivo, el momento del muestreo y la inoculación (p < 0,01) (Tabla S6A, B). El cultivar tuvo un efecto significativo sobre la diversidad eucariótica con más influencia durante el final de la temporada (media temporada: R2 = 0,12 (Tabla S6C), p = 0,007; final de la temporada: R2 = 0,37, p = 0,001 (Tabla S6D, MI)). Un aumento en los niveles de O3 afectó significativamente a las comunidades eucariotas durante la mitad de la temporada, mientras que no fue significativo durante el final de la temporada (mitad de la temporada: R2 = 0.22, p = 0.001 (Tabla S6C); final de la temporada: R2 = 0,06, p = 0,19 (Tabla S6D, E). El efecto de la inoculación en las comunidades eucariotas fue mayor durante la mitad de la temporada y disminuyó durante el final de la temporada (Fig. 3B) (mitad de la temporada: R2 = 0,15 , p = 0,003 (Tabla S6C); final de la temporada: R2 = 0,11 p = 0,03 (Tabla S6D, E)). La influencia del tiempo de muestreo en el agrupamiento fue evidente en la formación de comunidades bacterianas y eucarióticas (Fig. 3A, B).

Estos hallazgos indican que las comunidades microbianas en cultivares resistentes y susceptibles fueron similares en ausencia de cualquier estrés, ya sea patógeno o niveles elevados de O3, y la influencia de la sucesión estacional fue evidente tanto en las comunidades bacterianas como en las eucarióticas. La infección por patógenos condujo a un cambio en la composición de la comunidad bacteriana en el cultivar susceptible a medida que avanzaba la temporada de crecimiento. Sin embargo, a pesar de la presencia de la población de Xanthomonas en cultivares resistentes, la estructura de la comunidad microbiana fue similar a la observada en plantas no inoculadas. A pesar de los aumentos en la severidad de la enfermedad en el cultivar resistente bajo O3 elevado, las comunidades bacterianas y eucarióticas fueron similares en su composición a las del ambiente ambiental.

La presencia de Xanthomonas en plantas de control de cultivares susceptibles y resistentes sugirió niveles bajos de inóculo natural en el campo. Sin embargo, la abundancia relativa de Xanthomonas en las plantas de control no aumentó significativamente con el tiempo (<5 % al final de la temporada). Tanto la abundancia relativa como la absoluta de Xanthomonas aumentaron desde la mitad de la temporada hasta el final de la temporada en los cultivares susceptibles y resistentes inoculados (Fig. S2A, B). Cabe señalar una variación significativa en la abundancia relativa (~33–87 %) y absoluta (~13–37 %) de Xanthomonas en plantas resistentes inoculadas en condiciones elevadas de O3. Sin embargo, la presencia de O3 elevado no resultó en una diferencia significativa en la abundancia relativa (Kruskal-Wallis: pECW = 0.12, pX10R = 0.78) o absoluta (Kruskal-Wallis: pECW = 0.15, pX10R = 0.54) de Xanthomonas en cualquiera de los cultivares ( Fig. S2A, B). Esta observación fue sorprendente dado que los niveles de gravedad de la enfermedad en condiciones elevadas de O3 en plantas inoculadas resistentes fueron significativamente más altos que en el ambiente ambiental.

Para confirmar aún más la influencia del O3 elevado y los cultivares en la población de Xanthomonas, analizamos la población de X. perforans en la planta determinada mediante un método dependiente del cultivo para el día 7 y el día 14 después de la inoculación. Si bien este experimento de corta duración puede no reflejar el resultado de toda la temporada de crecimiento, nos permitió evaluar el efecto del O3 elevado en la población de Xanthomonas. De manera similar a las observaciones anteriores, no hubo un efecto significativo del ambiente (es decir, ambiente versus O3 elevado) en la población de X. perforans en estos cultivares (pECW = 0.31, pX10R = 0.34) (Fig. S2C).

Dado que el aumento de la gravedad de la enfermedad en el cultivar resistente con niveles elevados de O3 no fue el resultado de cambios en la población de Xanthomonas, planteamos la hipótesis de que este aumento se asoció con una reducción significativa en la densidad microbiana general asociada con el cultivo resistente con niveles elevados de O3 en comparación con el medio ambiente. ambiente, refiriéndose a un escudo profiláctico alterado de microbiota bajo niveles elevados de O3. Las estimaciones de densidad de microbiota se obtuvieron en función del contenido de ADN microbiano por mg de muestra, similares a las calculadas en estudios de microbioma intestinal [77]. Hubo un efecto significativo de la inoculación sobre la densidad de la microbiota (p < 0,001), mientras que ni el cultivar (p = 0,15) ni el O3 elevado (p = 0,19) tuvieron un efecto significativo sobre la densidad de la microbiota (Fig. 4A). Hubo una densidad de microbiota significativamente más baja en muestras de mitad de temporada en cultivar resistente inoculado bajo O3 elevado en comparación con cultivar susceptible (p = 0,01), pero no para muestras de final de temporada (p = 0,13) (Tabla S7A–D). Además, estimamos la abundancia absoluta de cada género bacteriano multiplicando su abundancia relativa (Fig. 4B) por el ADN total por mg de muestra. La abundancia absoluta general de microbiota fue menor en el cultivar resistente inoculado en comparación con el cultivar susceptible inoculado, en ambos ambientes, aunque esta diferencia no fue estadísticamente significativa, lo que explica la gran variación entre las muestras (Fig. 4C, Tabla S7E, F). La abundancia absoluta total de la microbiota asociada con el cultivo resistente inoculado en el entorno ambiental no fue significativamente diferente en comparación con la del entorno elevado de O3.

Un diagrama de caja y bigotes que muestra la densidad de la microbiota estimada mediante la cuantificación del ADN microbiano (concentración de ADN extraído por mg de muestras de hojas) para varios tratamientos en dos cultivares. B Abundancia de especies relativa (izquierda) y absoluta (derecha) de los 15 principales taxones bacterianos en las muestras. La abundancia absoluta se obtiene escalando las medidas de abundancia relativa por las medidas de densidad de microbiota. C Gráficas de barras que muestran la abundancia relativa de los 15 principales géneros eucariotas en las muestras. Las muestras inoculadas y de control se indican con barras amarillas y verdes en la parte superior, mientras que los tratamientos con O3 ambiental y elevado se indican con barras de color azul claro y rojo en la parte inferior, respectivamente. El tiempo de muestreo está indicado por Base (muestras iniciales), Medio (mitad de la temporada) y Fin (final de la temporada).

A continuación, investigamos la dinámica temporal en el ensamblaje y la sucesión de la comunidad en la filosfera, y se compararon los patrones entre las plantas inoculadas y las de control. En la información complementaria se proporciona una descripción taxonómica detallada de bacterias y eucariotas a través de diferentes tratamientos. El análisis de diversidad taxonómica mostró que varios géneros bacterianos (Fig. 4B, Tabla S8) y eucariotas (Fig. 4C, Tabla S9) monopolizan el entorno de la filosfera. Estos géneros microbianos se ven afectados de manera diferencial por la presencia de un patógeno, el estrés ambiental y su interacción.

A continuación, identificamos géneros que mostraron cambios en la abundancia relativa en respuesta a los cultivares o niveles elevados de O3. Los géneros bacterianos Pseudomonas, Pantoea, Methylobacterium, Sphingomonas, Methylobrum, etc., se vieron afectados negativamente, mientras que Microbacterium se vio influenciado positivamente en presencia de Xanthomonas en cultivares susceptibles (Fig. S3A–F). En contraste con el cultivar susceptible, la abundancia relativa de Pseudomonas y Sphingomonas aumentó en presencia de Xanthomonas en el cultivar de resistencia. El género bacteriano Methylobacterium se vio influido negativamente por el O3 elevado, mientras que los géneros Pseudomonas y Sphingomonas se vieron afectados positivamente en el cultivar resistente (Fig. S3G-L). En cuanto a los eucariotas, el género Bullera se vio afectado positivamente por el O3 elevado, mientras que los géneros Epicoccum y Protomyces tuvieron variación temporal independientemente del tratamiento (Fig. 4C).

Como la composición microbiana se vio significativamente afectada por el cultivo, la inoculación y el tiempo, buscamos investigar si las diferencias taxonómicas observadas reflejaban funciones microbianas específicas del nicho. Las funciones generales de la comunidad basadas en la abundancia relativa de vías metabólicas (Fig. 5A), así como las familias de genes asociadas que se mapearon en las vías (Fig. 5B) no se vieron afectadas por estos factores individuales (p> 0.05) (Tabla S10A, B ). Sin embargo, la interacción entre la inoculación, el cultivo y el tiempo de muestreo tuvo un efecto significativo en las funciones microbianas y las familias de genes (p < 0.01) (Tabla S10A, B), como lo indican las diferencias en la composición funcional de las familias de genes y las vías asociadas con comunidades recuperadas del cultivar susceptible inoculado en comparación con el cultivar resistente inoculado. Observamos un efecto significativo del cultivar durante el final de la temporada (p = 0,01) (Tabla S10C). El O3 elevado no alteró el ensamblaje funcional del microbioma de la filosfera en cultivares resistentes o susceptibles e independientemente del estado de inoculación. Observamos perfiles funcionales similares tanto en términos de genes como de vías a lo largo de los puntos de tiempo durante la temporada de crecimiento en los respectivos cultivares a pesar de las diferencias en la composición de especies a mediados y finales de las muestras de temporada. Esto probablemente se deba a una redundancia funcional sustancial en las vías metabólicas asociadas con las comunidades microbianas durante la temporada de crecimiento a pesar de la sucesión estacional de taxones en la filosfera.

Ordenación de escala multidimensional no métrica (NMDS) que muestra diversidad en las rutas metabólicas A en diferentes condiciones de tratamiento en cultivares susceptibles y resistentes, genes B asignados a rutas metabólicas en varias condiciones de tratamiento en cultivares susceptibles y resistentes.

Para encontrar vías diferencialmente abundantes que expliquen las diferencias entre los tratamientos en respuesta a la infección por patógenos, el O3 elevado y su interacción, realizamos un análisis discriminante lineal del tamaño del efecto (LEfSe). Tras la infección por patógenos y el O3 elevado, las vías metabólicas relacionadas con la eliminación de hemo (fuente de hierro biodisponible) se enriquecieron en comunidades microbianas recuperadas del cultivar resistente, mientras que las vías asociadas con el metabolismo de carbohidratos (vía de pentosa fosfato, degradación de galato, ciclo de glioxilato), protección (lípidos). Biosíntesis de IVA), crecimiento y mantenimiento (biosíntesis de fosfatidil glicerol, biosíntesis de CDP-diacilglicerol, biosíntesis de GDP-manosa) y metabolismo de ácidos grasos insaturados (biosíntesis de gondoato) se enriquecieron en comunidades microbianas recuperadas del cultivar resistente en condiciones ambientales (Fig. S4A ). Las vías metabólicas que se enriquecieron en las comunidades microbianas asociadas con ambos cultivares bajo estrés por O3 incluyeron vías involucradas en la producción de energía primaria y la degradación de ácidos grasos insaturados (beta-oxidación, pentosa fosfato), varias vías relacionadas con la defensa contra el estrés por oxígeno y la reparación del ADN (ubiquinol 7, pirimidina (desoxi)nucleótidos) y vías relacionadas con la respiración independiente del oxígeno (biosíntesis del hemo b independiente del oxígeno) (Fig. S4B). En presencia tanto del patógeno como del O3 elevado, se enriqueció la vía relacionada con la producción y degradación de nucleótidos de purina (Fig. S4C).

Para evaluar si la infección por patógenos y el estrés por O3 solos o en combinación afectaron la asociación microbiana general en la filosfera, se compararon las redes de co-ocurrencia bacteriana y sus características topológicas entre tratamientos. Evaluamos las medidas de centralidad de la red local utilizando el grado, la intermediación, la cercanía y la centralidad del vector propio utilizados para determinar los taxones centrales para las redes de co-ocurrencia bacteriana bajo O3 elevado (Fig. 6A), inoculación (Fig. 6B) y estrés combinado de O3 elevado y patógeno (Fig. 6C), y en comparación con el ambiente, la condición de control o la condición de control y el entorno ambiental, respectivamente. Observamos que todas las comparaciones de tratamientos mencionadas anteriormente mostraron diferencias significativas para todas las medidas de centralidad de la red local (Tabla S11A). Un taxón concentrador es un taxón altamente conectado y se sabe que tiene un fuerte impacto en la red. Hubo una diferencia significativa en los taxones centrales entre los grupos de tratamiento al comparar el control con las muestras inoculadas o el control y el ambiente ambiental con patógenos y estrés por O3 (Tabla S11A, B). Sin embargo, no hubo cambios en los taxones centrales de las plantas expuestas a niveles elevados de O3 en comparación con el entorno ambiental.

Comparación de la red de asociación bacteriana en diferentes entornos. Una red de asociación bacteriana para el conjunto de datos combinados de O3 ambiental (arriba) y elevado (abajo) en ambos cultivares en condiciones de control. B Red de asociación bacteriana para el conjunto de datos combinados de muestras de control (arriba) e inoculadas (abajo) de ambos cultivares en ambiente ambiental. C Red de asociación bacteriana para el conjunto de datos combinados de control y ambiente ambiental (arriba) y muestras inoculadas y con O3 elevado (abajo) de ambos cultivares. Los taxones centrales están resaltados con texto en negrita. El color del nodo representa el clúster determinado por la optimización de la modularidad codiciosa. Los bordes rojos corresponden a correlaciones negativas, mientras que los bordes verdes corresponden a correlaciones positivas.

La comparación de las similitudes generales de las dos redes entre el ambiente frente al estrés individual o el estrés combinado de O3 elevado y patógenos en función del índice de Rand ajustado (ARI) indicó valores cercanos a 0 (ARI = 0,02, p = 0,07) para ambiente frente a elevado estrés por O3; control frente a inoculado (ARI = 0,03, p = 0,02) y control y entorno ambiental frente a estrés combinado (ARI = 0,10, p < 0,001) (Tabla S11C). Estas observaciones indican que las particiones de especies en comunidades muestran un bajo grado de similitud en estas comparaciones. Estos resultados, con diferencias en la topología entre estas redes y disimilitud en las medidas de centralidad de la red local, indican que la combinación de infección por patógenos y estrés por O3 produce cambios en las interacciones de la comunidad bacteriana en la filosfera.

A continuación, evaluamos las propiedades de la red microbiana global, como el número de bordes como una medida de complejidad, modularidad, longitud de ruta promedio y coeficiente de agrupamiento, que comparan las topologías de red entre tratamientos [78, 79]. La versión actual de NetCoMi solo puede realizar 1000 permutaciones debido al alto tiempo de ejecución de una sola construcción de red. Dado que el valor de p mínimo posible para 1000 permutaciones es 1/1000, la potencia es bastante baja y esto da como resultado valores de p grandes después de ajustar para pruebas múltiples. Un número creciente de permutaciones puede permitir evaluar las propiedades de la red global con suficiente poder estadístico. Por lo tanto, en este estudio, nos enfocamos en las diferencias absolutas para cada parámetro bajo comparación, en lugar de los valores de p asociados. Las redes microbianas en el entorno ambiental mostraron un porcentaje de borde positivo más alto, un coeficiente de agrupamiento más alto y una longitud de ruta promedio más baja en comparación con O3 elevado (Tabla S11D). Esto sugiere interacciones más positivas en los entornos ambientales y que el estrés por O3 puede fomentar asociaciones menos complejas y negativas entre los miembros de la comunidad. Por el contrario, la presencia de infección por patógenos condujo a un porcentaje de borde más positivo, menor longitud de ruta, mayor modularidad y mayor coeficiente de agrupamiento, lo que sugiere que todos los nodos estaban altamente interconectados dentro de las redes para formar una red más compleja y estable bajo infección por patógenos. (Cuadro S11D). Sin embargo, en presencia de infección por patógenos y estrés por O3, se encontraron interacciones más positivas en el entorno ambiental y en condiciones de control con una longitud de ruta más baja y un coeficiente de agrupamiento más alto, lo que sugiere que el estrés combinado posiblemente crea asociaciones menos complejas y menos estables entre los miembros de la comunidad (Tabla S11D ).

El clima cambiante y las prácticas agrícolas modernas han predispuesto a los agroecosistemas a una mayor amenaza de plagas, lo que nos deja con la imprevisibilidad de cómo las plantas se adaptarán a los factores estresantes bióticos y abióticos simultáneos. Muchos estudios han propuesto el papel de los microbiomas asociados a las plantas para contribuir a la resiliencia de las plantas en el clima cambiante y extender la inmunidad de las plantas contra los patógenos [24, 30, 80, 81]. Sin embargo, todavía tenemos que comprender completamente cómo las comunidades microbianas responden y contribuyen a la adaptación de las plantas, en presencia de factores estresantes bióticos y abióticos simultáneos. En este estudio, probamos los efectos individuales y simultáneos del estrés elevado de O3 y patógenos en la estructura, función y estabilidad de la comunidad bacteriana y eucariótica de la filosfera, y en los resultados generales de enfermedades de las plantas en cultivares de pimiento susceptibles y resistentes. El cultivo de pimiento resistente utilizado en este estudio posee genes de resistencia que proporcionan un nivel intermedio de resistencia contra todas las razas de pimiento conocidas actualmente de la mancha bacteriana Xanthomonas [82]. Nuestra justificación para incluir este cultivar en el diseño de este estudio fue comprender la durabilidad de este cultivar resistente que actualmente se implementa ampliamente en el sureste de los EE. UU. en respuesta a especies de patógenos emergentes y bajo O3 elevado, lo que representa el clima futuro.

Si bien no se observó la influencia aparente del O3 elevado en los niveles de severidad de la enfermedad en el cultivar susceptible, el cultivar resistente mostró una mayor severidad de la enfermedad bajo el O3 elevado a lo largo de la temporada de crecimiento en comparación con el ambiente ambiental (Fig. 1). Este cambio en la gravedad de la enfermedad también puede ser indicativo de erosión de la resistencia en condiciones elevadas de O3. Desafortunadamente, la elección de los cultivares utilizados en este estudio que no son casi isogénicos nos impide evaluar la influencia de los loci de resistencia en el microbioma como se hizo en estudios anteriores [83]. Sin embargo, el aumento de la gravedad de la enfermedad observado en el cultivar resistente bajo niveles elevados de O3 no se asoció con el aumento de la población de Xanthomonas según lo estimado por los datos de abundancia absoluta en comparación con el entorno ambiental. Tal método de secuenciación de ADN independiente del cultivo puede no indicar con precisión el recuento de células vivas de patógenos y puede garantizar la confirmación de estos hallazgos con una estimación de la población de patógenos dependiente del cultivo o con métodos como PCR cuantitativa (qPCR) [84, 85], PCR de gotas digitales [86, 87]. Aunque no durante toda la temporada de crecimiento, monitoreamos la dinámica de la población de Xanthomonas durante un experimento a corto plazo de 2 semanas y los resultados respaldaron los hallazgos anteriores de que la población de Xanthomonas no se vio afectada a pesar de la mayor gravedad de la enfermedad bajo O3 elevado en el cultivar resistente. Curiosamente, valió la pena señalar la alta variabilidad en los recuentos de la población de Xanthomonas en el cultivar resistente bajo niveles elevados de O3. Esto puede indicar una respuesta plástica del patógeno durante la adaptación al cultivar resistente en un ambiente alterado.

Una gran cantidad de trabajo ha indicado que las fluctuaciones climáticas pueden tener un efecto profundo en el resultado de las interacciones planta-patógeno [88,89,90], lo que puede resultar de la alteración del entorno del huésped a través de la modificación de las vías de defensa del huésped, el aumento de la infección por patógenos eficiencia en ambientes alterados, o alteración en la inmunidad extendida proporcionada por el microbioma. Estas tres explicaciones plausibles se describen a continuación y podrían impulsar de manera sinérgica las interacciones planta-patógeno-microbioma y ayudar a explicar la observación de este estudio de la erosión de la resistencia potencial en condiciones elevadas de O3.

Los estudios sobre la respuesta de las plantas a una combinación de estrés abiótico y biótico han mostrado una respuesta única y más compleja que la de los estreses individuales [38, 91, 92, 93]. El efecto del estrés combinado se rige por varios factores, como el tiempo, el grado de estrés, el genotipo de la planta y otros factores climáticos o ambientales, por lo que no es necesariamente de naturaleza aditiva [94]. Las plantas responden al estrés biótico y abiótico a través de vías de señalización de defensa complejas pero superpuestas [95, 96], con la inducción de la vía del ácido abscísico (ABA) observada en el estrés abiótico, que antagoniza la vía del ácido salicílico (SA) involucrada en la defensa de patógenos [97 , 98]. El estrés simultáneo de la infección por patógenos y el O3 elevado pueden dar como resultado una respuesta inmunitaria alterada del huésped en el cultivar resistente. El daño oxidativo de la cutícula de la planta causado por niveles elevados de [O3] puede aumentar la exposición a patógenos y, por lo tanto, afectar la gravedad de la enfermedad [99]. Complementar este estudio actual con la transcriptómica del huésped explicará si tal alteración de la defensa del huésped puede ser lo que explique la mayor susceptibilidad en cultivares resistentes en presencia de O3 elevado. En segundo lugar, el aumento de la virulencia del patógeno a través del aumento de la producción de efectores [89] en un entorno alterado puede explicar el aumento de la gravedad de la enfermedad en ausencia de un aumento significativo en la población de patógenos. La mayor variación en la población de patógenos podría deberse a la respuesta plástica del huésped o a la plasticidad de la población de patógenos.

La tercera y más importante explicación de las observaciones de este estudio es la alteración en la protección mediada por microbiomas en el cultivar resistente en respuesta al O3 elevado y la infección por patógenos. Las comunidades microbianas reclutadas por el cultivar resistente en la filosfera podrían tener un papel protector contra el patógeno como se ha demostrado en estudios previos [13, 100] y este papel protector puede haberse alterado bajo niveles elevados de O3, lo que puede haber llevado a un aumento de la enfermedad. gravedad. La composición, estructura y función de la comunidad bacteriana y eucariótica en el cultivar susceptible no difirió en ausencia de infección por patógenos o niveles elevados de O3. Sin embargo, la estructura de la comunidad bacteriana en el cultivar resistente estuvo influenciada por la presencia de O3 elevado, pero en ausencia del patógeno. Queda por determinar si tal influencia diferencial en la estructura de la comunidad microbiana se debe a loci de resistencia específicos, ya que los cultivares que investigamos no eran líneas casi isogénicas para los loci de resistencia. En el cultivar susceptible, la presencia de infección patógena provocó un cambio considerable en la estructura y función de la comunidad bacteriana, aunque el estrés concurrente de O3 no alteró más la estructura y función del microbioma. Aunque no se observó un cambio significativo en la estructura y función del microbioma en el cultivo resistente tras la infección, la densidad general de microbiota asociada con el cultivo resistente infectado fue menor en comparación con el cultivo susceptible infectado. Además, el estrés por O3 concurrente resultó en una menor densidad de microbiota total durante el muestreo de mitad de temporada en el cultivar resistente infectado. Queda por investigar si dicha reducción refleja un potencial profiláctico deteriorado del microbioma asociado con cultivares resistentes bajo el impacto combinado de O3 elevado e infección por patógenos. Se pueden diseñar experimentos adicionales para evaluar la protección mediada por microbiomas contra patógenos usando comunidades sintéticas asociadas con el cultivar resistente, similar a los estudios previos [101]. Estos experimentos pueden brindar oportunidades para diseccionar la influencia del medio ambiente alterado en la abundancia absoluta de los miembros individuales de la comunidad y sus interacciones, y los rasgos funcionales asociados. Curiosamente, nuestros datos no revelaron ninguna influencia de factores estresantes simultáneos en las funciones de las comunidades microbianas asociadas con el cultivar resistente. Esto fue sorprendente dado que los estudios previos indican el enriquecimiento de rutas metabólicas específicas bajo factores de estrés abióticos o bióticos [102,103,104].

La función microbiana en el ecosistema está determinada no solo por el número y la composición de los taxones, sino también por las diversas asociaciones positivas, negativas, directas o indirectas entre los miembros de la comunidad [105]. En respuesta al desafío del patógeno, observamos parámetros de red indicativos de una red densamente conectada. Estos hallazgos de asociación positiva y compleja mejorada entre las comunidades microbianas tras la infección por patógenos se han observado tanto en la filosfera como en la endosfera [106,107,108]. Una red tan densamente conectada indica una asociación cooperativa como la facilitación, el mutualismo o el comensalismo y la alimentación cruzada [79, 109]. Se supone que tales redes conectadas, denominadas redes de mundo pequeño [110], albergan resistencia a las perturbaciones. Por el contrario, las redes de coocurrencia microbiana a través del estrés por O3 y el estrés simultáneo por patógenos y O3 mostraron una tendencia similar de una red aleatoria relativamente inestable en comparación con el entorno de control. Este hallazgo concuerda con la noción de que diversos grados de estrés ambiental alteran la estabilidad de las comunidades microbianas [79]. La observación de la similitud del nodo más central sugiere que las comunidades microbianas son considerablemente diferentes entre los diferentes tratamientos. La presencia de un patógeno y el estrés simultáneo de patógeno y O3 afectó considerablemente a los taxones centrales. Sin embargo, los estresores simultáneos, pero no los estreses individuales, tuvieron una influencia considerable en los taxones más influyentes, lo que sugiere que las plantas responden a estreses simultáneos cambiando el miembro microbiano más influyente en la red aleatoria. Sería interesante analizar más a fondo la influencia del cultivar individual y, por lo tanto, la influencia de las respuestas de defensa del huésped en las redes de la comunidad microbiana, ya que observamos un fuerte efecto del cultivar en la composición de la comunidad. Sin embargo, el presente estudio tiene un tamaño de muestra limitado, lo que no permite suficiente potencia para comparar la estructura de la red entre cultivares individuales. Como observamos que el O3 elevado impactó a las comunidades eucarióticas más fuertemente que las comunidades bacterianas y la infección por patógenos impactó a las comunidades bacterianas, no se puede descartar la influencia en las interacciones entre reinos en este caso. Sin embargo, el presente estudio tiene limitaciones para determinar cómo los factores estresantes específicos y concurrentes afectan las interacciones entre reinos debido a la ausencia de métodos apropiados para evaluar la abundancia relativa de comunidades eucariotas utilizando datos de metagenoma de escopeta. Es posible que un nivel elevado de O3 tenga un impacto en las interacciones entre reinos, como se ha demostrado con otros factores de estrés abióticos [30].

En general, nuestro estudio demostró que las comunidades microbianas responden a un cambio no solo alterando la composición de la comunidad, sino también las interacciones entre los miembros y la función general de la comunidad. Este trabajo proporciona una base para nuestra comprensión de la compleja respuesta de las comunidades microbianas y sus interacciones con el genotipo del huésped en respuesta a un clima cambiante. A medida que las plantas han evolucionado en asociación con sus miembros del microbioma de la filosfera, los miembros de la comunidad identificados en este estudio han demostrado ser particularmente susceptibles a un cambio en respuesta al estrés abiótico o al estrés combinado. Los hallazgos de este estudio son cruciales para evaluar el trabajo futuro sobre el aprovechamiento del microbioma para plantas tolerantes al estrés.

Los datos de secuencia generados a partir de este trabajo se han depositado en la base de datos SRA (Sequencing Read Achieve) bajo las accesiones de BioProject PRJNA889178. Todos los demás datos y códigos utilizados en este estudio están disponibles en el siguiente repositorio de GitHub (https://github.com/Potnislab/AtDep_2021_metagenome).

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Damos las gracias a Auston Holland por su ayuda en el mantenimiento de las plantas en el invernadero y durante todo el experimento. Agradecemos a los miembros de los laboratorios Potnis, Leisner y Sanz-Saez por su ayuda con la siembra inicial. Agradecemos a Seth Johnston por configurar y mantener los OTC y la fumigación. Agradecemos al Dr. David Young y al personal de la Autoridad de Supercomputadoras de Alabama por brindar los recursos computacionales necesarios para realizar este trabajo.

Este trabajo fue apoyado por la Estación Experimental Agrícola de Alabama y el programa Hatch (Proyecto # 10108601) del Instituto Nacional de Alimentos y Agricultura, Departamento de Agricultura de los Estados Unidos.

Departamento de Entomología y Patología Vegetal, Universidad de Auburn, Auburn, AL, 36849, EE. UU.

Rishi Bhandari y Neha Potnis

Departamento de Cultivos, Suelo y Ciencias Ambientales, Universidad de Auburn, Auburn, AL, 36849, EE. UU.

Alvaro Sanz-Saez

Departamento de Ciencias Biológicas, Universidad de Auburn, Auburn, AL, 36849, EE. UU.

Courtney P.Leisner

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NP, ASS y CPL conceptualizaron y diseñaron el estudio. RB contribuido al diseño experimental, llevó a cabo la recogida de muestras y el procesamiento de muestras. RB y NP analizaron los datos y escribieron el manuscrito con aportes de todos los autores.

Correspondencia a Neha Potnis.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Bhandari, R., Sanz-Saez, A., Leisner, CP et al. La infección por Xanthomonas y el estrés por ozono influyen claramente en la estructura de la comunidad microbiana y las interacciones en la filosfera del pimiento. ISME COMÚN. 3, 24 (2023). https://doi.org/10.1038/s43705-023-00232-w

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Recibido: 25 de octubre de 2022

Revisado: 08 de marzo de 2023

Aceptado: 15 de marzo de 2023

Publicado: 27 de marzo de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s43705-023-00232-w

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